microRNA: determinar los perfiles de expresión mediante secuenciación masiva
Objetivo:
En esta sesión vamos a analizar algunas propiedades de los microRNAs. Vamos a aprender cómo (i) usar la base de datos miRBase, (ii) analizar los patrones de conservación de los microRNAs, (iii) detectar los niveles de expresión y los microRNAs que se expresan de forma diferencial entre dos condiciones.
Programas que vamos a necesitar
El editor de texto: Notepad++
Información general
La base de datos más importante referente a los microRNA se llama miRBase. Podemos descargar todas las secuencias de los microRNA, buscar información acerca de uno en concreto o en función de la especie.
Cuestiones:
- Los nombres de los microRNA maduros del microRNA asignado
- Secuencias del pre-microRNA y de los microRNAs maduros
- ¿cual de los microRNAs maduros es el funcional (5p o 3p)?
Detectar los perfiles de expresión y expresión diferencial
Para detectar los perfiles de expresión de los microRNAs y la posible expresión diferencial usaremos el programa sRNAbench
Usaremos datos de cáncer de mama para comprobar cuáles de los ocomiRs que estamos analizando se expresan de forma diferencial entre el tejido sano y el canceroso. La descripción de los datos podemos encontrar aquí.
No tenemos que descargar los datos, podemos facilitar directamente un enlace:
Por ejemplo para los datos con ID: SRR518946
ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR518/SRR518946/SRR518946.sra
IDs de los procesos de prueba:
JDXCE500DPI8QZZ:NOW8PTCSXGDGOOF:LPCUAXR1XW5GI2V#BYLZKUGOXLIVVZP:8ZSDIBIWM8E6BCP:UT013BRQTGP8W41
Adenoma#Carcinoma
Cuestiones:
- ¿Cuántos isomiRs tiene el microRNA?
- ¿La secuencia anotada en miRBase es la más frecuente en el análisis?
- ¿Qué es el nivel de expresión del microRNA en la muestra analizada?
- ¿El microRNA muestra expresión diferencial?
Análisis Funcional
Para detectar términos funcionales de los microRNAs que se sobre o infra-expresan podemos usar el programa miRPath
Cuestiones:
- ¿En que rutas los target genes estan sobrerepresentados?
- ¿Que genes están regulados en estas rutas?
Conservación / región del seed
Fichero de prueba miR-139
Descargamos el fichero de familias (en la sección de descargas) o directamente de este enlace (miFam.txt).
Buscamos la familia miR-139 una y descargamos (mediante la opción de ‘search’ & ‘Get sequence’) las secuencias de 5 miembros de la familia (en 5 especies diferentes) poniendo las secuencias en un fichero multifasta.
Mediante el programa ClustalW2 podemos alinear las secuencias y determinar las regiones conservadas.
Cuestiones:
- ¿Cuáles son las regiones más conservadas en los alineamientos?
- ¿Cuántas substituciones se observa en el pre-microRNA, microRNA maduro, región del seed?
- ¿Cuál es la especie evolutivamente más alejado de los humanos en la que se encuentra el microRNA asignado al alumno?