{"id":3541,"date":"2017-11-28T10:39:31","date_gmt":"2017-11-28T08:39:31","guid":{"rendered":"http:\/\/bioinfo2.ugr.es\/genomica\/?page_id=3541"},"modified":"2019-09-08T10:02:15","modified_gmt":"2019-09-08T08:02:15","slug":"variabilidad_genetica","status":"publish","type":"page","link":"https:\/\/bioinfo2.ugr.es\/genomica\/variabilidad_genetica\/","title":{"rendered":"Variabilidad Gen\u00e9tica y Detecci\u00f3n de Variantes"},"content":{"rendered":"

Objetivos<\/span><\/h2>\n

El objetivo de este ejercicio es la detecci\u00f3n de variantes (SNPs e indels) en ADN gen\u00f3mico extra\u00eddo de una \u00fanica persona y enriquecido en exoma<\/strong>, utilizando para ello un peque\u00f1o conjunto de lecturas cortas (single-end)<\/strong> del cromosoma 22<\/strong> obtenidas mediante NGS en un equipo Illumina GAIIx . Se trata de aproximadamente un mill\u00f3n de lecturas de 76bp (210 Mb en total).<\/p>\n

El ADN procede de una mujer cauc\u00e1sica de los EEUU que ha sido resecuenciado multitud de veces, por lo que esta mujer es actualmente uno de los seres humanos mejor caracterizados gen\u00e9ticamente. Su familia fue uno de los 30 trios de los proyectos Hapmap y 1000 Genomas.<\/p>\n

El ADN gen\u00f3mico se extrajo a partir de c\u00e9lulas sangu\u00edneas, enriqueci\u00e9ndolo a continuaci\u00f3n en secuencias del exoma. Para ello, se purificaron utilizando oligonucle\u00f3tidos espec\u00edficos en microarrays. Este proceso de enriquecimiento no es perfecto, por lo que en la muestra final puede haber algo de contaminaci\u00f3n de ADN no-ex\u00f3mico, asi como ADN mitocondrial.<\/p>\n

Filtraremos las variantes obtenidas manualmente, de forma que se comprenda bien el procedimiento. En el mundo real, los conjuntos de datos empleados en la detecci\u00f3n de variantes son mucho m\u00e1s grandes y las herramientas bastante m\u00e1s sofisticadas, ya que se basan en modelos estad\u00edsticos de la representaci\u00f3n de las variantes en el conjunto de las lecturas.<\/p>\n

\n

Importaci\u00f3n de los datos<\/span><\/h2>\n
    \n
  1. Conectese a Galaxy<\/a> y entre en su cuenta (reg\u00edstrese si es necesario). Servidor de Galaxy alternativo<\/a>.<\/li>\n
  2. Copie este enlace: http:\/\/bioinfo2.ugr.es\/DatosClase\/NA12878.GAIIx.exome_chr22.1E6reads.76bp.fastq.<\/li>\n
  3. En el panel izquierdo de Galaxy abra Get Data -> Upload File<\/em> -> Paste\/Fetch data<\/em> y pegue ese enlace en el cuadro de texto que aparece.<\/li>\n
  4. En el campo Type<\/em> elija fastqsanger<\/em>, en el campo Genome<\/em> elija el ensamblado Human Feb 2009 (GRCh37\/ hg19) (hg19) <\/em>y pulse Start.<\/em><\/li>\n
  5. Cuando acaben de cargarse los datos, ed\u00edtelos (herramienta\u00a0[icon name=”pencil” class=”” unprefixed_class=””] (L\u00c1PIZ) en el item de la historia) y simplifique el nombre a\u00a0 NA12878.GAIIx.exome_chr22.1E6reads.76bp.fastq<\/em>.<\/li>\n
  6. Aseg\u00farese de que el formato es fatsqsanger<\/em> y el ensamblado hg19<\/em>.<\/li>\n
  7. Si el formato fuese otro, c\u00e1mbielo editando los datos -> Datatype<\/em> y elija fastqsanger<\/em>.<\/li>\n<\/ol>\n
    \n

    Control de calidad<\/span><\/h2>\n

    Examine las lecturas pinchando en la herramienta [icon name=”eye” class=”” unprefixed_class=””] (OJO) del item\u00a0 NA12878.GAIIx.exome_chr22.1E6reads.76bp.fastq.<\/em><\/p>\n

    Note que en el formato fastq <\/a>cada lectura est\u00e1 representada por 4 l\u00edneas:<\/p>\n

      \n
    1. Identificador o nombre<\/li>\n
    2. Secuencia<\/li>\n
    3. Separador<\/li>\n
    4. L\u00ednea de calidad<\/li>\n<\/ol>\n

      Analice la calidad de las lecturas con FASTQC: En el panel izquierdo de Galaxy<\/strong>, seleccione NGS: QC and manipulation \u2013> FASTQC Read Quality Reports<\/strong>.<\/em><\/p>\n

      Aparecer\u00e1 seleccionado por defecto el fichero con los datos (extension .fastq).<\/p>\n

      Deje las dem\u00e1s opciones por defecto y pinche en Execute<\/em><\/strong>. Cuando termine el proceso, aparecer\u00e1n dos items nuevos en su historia, uno con los resultados en forma num\u00e9rica y otro en html (Webpage). Seleccione este \u00faltimo item y pinche en la herramienta\u00a0[icon name=”eye” class=”” unprefixed_class=””] (OJO) para examinar los resultados.<\/p>\n

      Aparecer\u00e1 un FastQC Report<\/em> conteniendo una lista de gr\u00e1ficos con las medidas de calidad. Examine el gr\u00e1fico Per base sequence quality. <\/strong>Observe que los datos parecen bastante buenos, la mayor\u00eda de los scores est\u00e1n por encima de 30, lo que corresponde a una precisi\u00f3n del 99.9% (v\u00e9ase una explicaci\u00f3n de los Phred Quality Scores<\/a>).<\/p>\n

      Note tambi\u00e9n que el gr\u00e1fico Sequence Duplication Levels<\/strong> revela que hay una tasa de duplicaci\u00f3n muy alta en las lecturas (artefacto debido a la PCR). Ello requerir\u00eda\u00a0 emplear una herramienta espec\u00edfica para eliminar dicha redundancia, aunque por brevedad aqu\u00ed nos saltaremos ese paso.<\/p>\n

      \n

      Alineamiento<\/span><\/h2>\n

      Se trata de alinear o mapear cada lectura de la muestra de ADN (NA12878.GAIIx.exome_chr22.1E6reads.76bp.fastq<\/em><\/strong>) con el genoma de referencia (hg19<\/em><\/strong>), de forma que podamos identificar las variantes (SNVs, SNPs o indels).<\/p>\n

      NGS: Mapping \u2013> Map with BWA for Illumina<\/strong>:<\/em><\/p>\n

        \n
      1. Use el fichero FASTQ por defecto (NA12878.GAIIx.exome_chr22.1E6reads.76bp.fastq<\/em>)<\/li>\n
      2. Seleccione Human (Homo sapiens) (b37): hg19<\/em> como genoma de referencia<\/li>\n
      3. Deje las dem\u00e1s opciones por defecto<\/li>\n
      4. Pinche en Execute<\/em><\/strong><\/li>\n<\/ol>\n

        Este es el paso que m\u00e1s tarda (5-20 minutos, dependiendo de la carga que tenga el servidor de Galaxy en ese momento).<\/p>\n

        Cuando termine el proceso, pinche en la herramienta [icon name=”eye” class=”” unprefixed_class=””] (OJO) y examine el alineamiento en formato SAM<\/a> (Sequence Alignment Map).<\/p>\n

        Observe que muchas lecturas no mapean en el cromosoma 22 (columna 3). Para quedarnos solamente con aquellas lecturas que mapean correctamente en el cromosoma, debemos filtrar estos resultados:<\/p>\n