Filtrado y validación de los SNPs (SNP calling)

• Para obtener información más detallada sobre cada posición del alineamiento, usaremos el programa Generate pileup. Este programa facilita la selección e identificación de los SNPs más relevantes. Ejecute pileup sobre las lecturas alineadas que obtuvo en el ejercicio anterior (SAMtools –> Generate Pileup). Mantenga todas las opciones por defecto, excepto Call consensus according to MAQ model –> Yes. Esto genera una base de consenso en cada posición cromosómica. Este cambio anterior abrirá más opciones; manténgalas todas por defecto y pinche en ‘Execute‘.
• Cambie a formato pileup el archivo que acaba de generar: Herramienta lápiz –> Datatype –> pileup. El archivo pileup resume los datos de las lecturas en aquellas regiones genómicas cubiertas por al menos una lectura.
• Para aumentar la calidad de las variantes obtenidas, aplicaremos dos filtros sucesivos:
  1. Filter Pileup
     • Select ‘Pileup with ten columns (with consensus)’
     • Do not report positions with coverage lower than = 10
     • Convert coordinates to intervals = Yes
  2. Filter and Sort –> Filter
     • Seleccione los SNPs que tengan ‘c7>50′.  La columna 7 contiene un score que combina varias medidas de calidad, como la cobertura o la calidad por posición.

¿Cuántas variantes encontramos tras los filtros utilizados?

Visualización en Genome Browser y validación con dbSNP

• Mediante el pileup filtrado podemos identificar posiciones en homocigosis o heterocigosis y visualizarlas en los alineamientos de las lecturas como los ejemplos siguientes:

Variante en homocigosis anotada en dbSNP:

Si hacemos clic en la variante de dbSNP, podemos obtener información adicional de dicha variante.

Así pues, se trata de una variante homocigótica A/G que provoca un cambio no-sinónimo en la segunda posición de un codón que codifica para Isoleucina –> Treonina.

Encuentra una variante adicional en heterocigosis e inspecciona la información disponible en dbSNP para la misma.